Fleming 1. Dünya Savaşının başladığı yıllara kadar bilimsel araştırmalarına devam ediyordu. Savaş başladıktan sonra yüzbaşı rütbesiyle Fransa’ya gönderilir. Savaş sırasında yaralıları tedavi ederken, çeşitli antiseptik ilaçların yaralılara zararlı olduğunu fark etti. Bu antiseptik ilaçlar vücuttaki mikropları öldürmesinin yanı sıra kanda bulunan koruyucu akyuvarları da öldürüyordu. Böylece Fleming, bir antiseptik bulmayı kafasına koydu. Savaş bittikten sonra geri dönen Fleming çalışmalarını sürdürmeye devam etmiştir.

Laboratuarında yaptığı incelemeler sırasında rastlantı eseri jelatin tabakların birinde küf görür. Bu küfü inceleyen Fleming jelatin tabakta bulunan öldürücü bakteriyi yok ettiğini fark etti. Bu küfe penisilin adını vererek araştırmaların daha da genişletti. Bulduğu küfü çeşitli hastalıklara sahip hayvanlar üzerinde denedi. Yeterli parası olmadığı için araştırmalarının sonuna gelmişti. Çeşitli bilim adamlarından yardım istedi fakat yeterli ilgiyi göremedi. 1939 yılında Florey ve Chain adlı İngiliz bilim adamları, Fleming’in ürettiği penilisin ile ilgilenmeye başladılar. 1941 yılında, penisilin insan kanına enjekte edilerek, penisilinin ilk defa insan üzerinde kullanılması gerçekleşti. Enjekte edilen ilk insan ise, ölüm döşeğinde olan bir polisti. Penisilin enjekte edilen polis beş gün süreyle penisilin iğnesi yedi ve tekrardan normal hayatına dönebildi. 1944 yılında Florey,Chain ve Fleming İngiltere’de “ Şövalye ” unvanına sahip oldular.